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Fluoreszenzmikroskopie
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Begriffe
Die Fähigkeit eines Körpers zu leuchten, wenn er von einer Lichtquelle
angestrahlt wird, bezeichnet man allgemein als Lumineszenz.
Dabei werden zwei Fälle unterschieden:
- Phosphoreszenz: Das Leuchten des Körpers
hält an, auch wenn er nicht mehr angestrahlt wird. Es klingt u.U. langsam
ab.
- Fluoreszenz: Leuchterscheinung und Anstrahlung
sind streng gekoppelt. Wird der Körper nicht mehr angestrahlt, so schwindet
auch die Leuchterscheinung.
Der Ausdruck Fluoreszenz stammt von Flußspat (Fluorit) her, der diese Fluoreszenz zeigt. Die
Fluoreszenz ist ein monomolekularer Vorgang, der durch Auswahlregeln und Übergangswahrscheinlichkeiten bestimmt wird.
Ihre Intensität fällt nach dem Ende der Anregung (z.B. Beleuchtung) exponentiell ab. Selbst bei starker Anregung
tritt keine Sättigung ein.
Die Fluoreszenz gehorcht normalerweise der Stokesschen Regel: diese besagt, daß ein gewisser Teil der eingestrahlten
Lichtenergie nicht als Licht zurückgestrahlt wird, sondern z.B. als Wärme abgegeben wird. Daher wird das angeregte
Licht normalerweise langwelliger (energieärmer) als das anregende Licht.
Als energiereiche Lichtquelle werden meistens aufwendige Lampenhäuser mit Quecksilberhöchstdruckdampflampen eingesetzt. Diese
Lampen sind sehr empflindlich und haben eine ziemlich kurze Lebensdauer. Für Schulungs- und Ausbildungszwecke kann diese
aufwendige Beleuchtung auch durch eine geeignete Leuchtdiode ersetzt werden. Da diese Leuchtdiode passend zur benötigten
Anregungsfrequenz ausgewählt werden kann, ergeben sich konstruktive Möglichkeiten, den Filterblock einfacher und somit
auch preiswerter zu gestalten und darüberhinaus auf das aufwendige Lampenhaus mit der problematischen
Quecksilberhöchstdruckdampflampe zu verzichten.
Nachfolgend soll lediglich die Fluoreszenz näher betrachtet werden
mit ihrer Anwendung in der Mikroskopie.
Physikalische Grundlagen
Wird ein Präparat mit Licht bestrahlt - wird es beleuchtet - so wird
ihm Lichtenergie zugeführt. Diese Lichtenergie kann entweder von den
Atomen oder Molekülen des Präparates selbst absorbiert werden oder
von den Atomen oder Molekülen eines Farbstoffes, mit dem das Präparat
vorher eingefärbt wurde.
Diese zugeführte Energie versetzt die jeweilige Substanz in einen energetisch
höheren Zustand, wobei die Lichtenergie in andere Energieformen umgewandelt
werden kann, z.B. in Schwingungsenergie (Schwingen von Atomen und Molekülen
um ihre Gleichgewichtslage), Rotationsenergie (Rotieren eines Moleküls
um seinen Schwerpunkt) und Anregungsenergie (Elektronen der Atome und Moleküle
werden in einen "angeregten" Zustand gebracht).
Der energieärmste Zustand ist normalerweise der stabilste Zustand,
und so versucht eine Substanz nach Energiezufuhr, diesen stabilen Grundzustand
wieder einzunehmen, d.h. die überschüssige Energie abzugeben. Für
die angeregten Elektronen bedeutet dies, daß sie nach kürzester
Zeit (10-5 sec bis 10-8 sec) ihren Grundzustand wieder einnehmen, wobei die
überschüssige Energie in Form von
- Wärme
- chemischer Energie (dies kann zur Zerstörung oder Umwandlung des
Stoffes führen)
- elektromagnetischer Energie (z.B. Licht)
abgegeben werden kann.
Die Abgabe der Energie in Form von Licht ist die Basis der Fluoreszenzmikroskopie.
Das Präparat wird mit Licht bestrahlt und gibt wiederum Licht ab, so
lange es bestrahlt wird.
Manche Stoffe (z.B. Chlorophyll, Öle, optische Aufheller) fluoreszieren
ohne jede Vorbehandlung. Man spricht dann von Eigen-, Auto- oder Primärfluoreszenz.
In den meisten Fällen jedoch (z.B. Zellen, Gewebe, Bakterien) muß
ein Präparat vorbehandelt werden, d.h. es wird mit Materialien angefärbt,
die charakteristische Fluoreszenzfarben erzeugen. Solche Farbstoffe heißen
Fluorochrome. Die von ihnen hervorgerufene Fluoreszenz heißt Sekundärfluoreszenz.
Von ihr wird üblicherweise in der Mikroskopie gesprochen, wenn nicht
ausdrücklich etwas anderes gemeint ist.
Die Energie des Lichtes ist von seiner Frequenz abhängig. Dabei besteht
folgender Zusammenhang:
E = h * f
(1)
E = Energie des Lichtes
h ist eine Konstante (Plancksches Wirkungsquantum (6,626196 ± 0,000050) * 10-34 J * s)
oder wegen c = f * λ
f = Frequenz (Zahl der Schwingungen pro Sekunde)
c = Geschwindigkeit des Lichtes
λ= Wellenlänge des Lichtes
h
* c
E = ----------------
(2)
λ
Das heißt in Worten:
Je größer die Frequenz, desto größer die Energie
(1)
oder
Je kleiner die Wellenlänge, desto größer die Energie
(2)
Blaues Licht hat im sichtbaren Spektrum die größte Frequenz und
damit die größte Energie - und die kleinste Wellenlänge.
Rotes Licht hat die kleinste Frequenz und damit die geringste Energie -
und die größte Wellenlänge.
In biologisch/medizinischen Präparaten wird die eingestrahlte Energie
nicht ausschließlich wieder in Form von Licht abgegeben, sondern ein
Teil wird auch in Form von Wärme zurückbehalten. Das hat zur Folge,
daß das abgegebene Licht weniger Energie hat als das eingestrahlte (Stokessche
Regel).
Damit ergibt sich folgende Übersicht über Begriffe/Zusammenhänge:
Lichtanregung
Lichtabgabe
-------------------------------------------------------------
Excitation
Emission
Anregungslicht
Fluoreszenzlicht
Eingestrahlte Energie >
abgegebene Energie
Anregungswellenlänge <
Fluoreszenzwellenlänge
Excitationswellenlänge <
Emissionswellenlänge
Fluoreszenzmikroskopie
In der gebräuchlichen Hellfeldmikroskopie werden Präparate durch
Lichtabsorption (Färbung) bzw. durch abgebeugtes Licht (Phasenkontrast,
Dunkelfeld) dem menschlichen Auge differenziert dargestellt. Das Gesichtsfeld
erscheint in der Durchlicht-Hellfeld-Betrachtung hell, die Objektstrukturen
heben sich farbig bzw. hell/dunkel von ihrer Umgebung ab.
Im Fluoreszenzmikroskop sieht dies ganz anders aus. Der gesamte Bilduntergrund
erscheint grundsätzlich dunkel, und nur die Stellen, an denen fluoreszierende
Substanzen/Strukturen vorliegen, leuchten in ihren typischen Fluoreszenzfarben
auf.
Das hat gerade in der medizinischen Diagnostik erheblich Vorteile.
Falls z.B ein Stoff (etwa eine bestimmte DNA-Sequenz als Ursache für
eine Erbkrankheit), nach dem gefahndet wird, vorhanden ist, leuchtet er auf,
falls nicht, bleibt das Gesichtsfeld dunkel. Die Frage nach seinem Vorhandensein
kann also nur mit Ja / Nein beantwortet werden, ein "Jein" scheidet aus.
Weitere Vorteile sind:
- hohe Nachweisempfindlichkeit
- hohe Spezifität
Als Nachteile sind zu werten:
- Fading (Abklingen der Fluoreszenzintensität).
- unspezifische Eigenfluoreszenz.
- Standardisierung der Färbetechniken.
Auflichtfluoreszenz
Grundsätzlich kann Fluoreszenz sowohl im Auflicht als auch im Durchlicht
angewandt werden. Die Auflichtfluoreszenzmikroskopie hat jedoch im Vergleich
zur Durchlichtfluoreszenz einige Vorteile.
Die nachfolgende Schemazeichnung zeigt den grundsätzlichen Aufbau einer
Auflichtfluoreszenzeinrichtung.
Anregungsfilter
Das erste Filter nach der Lichtquelle ist das Anregungsfilter, das aus
dem gesamten Wellenlängenspektrum der Lampe den Bereich auswählen soll,
der zur Anregung des gewählten Fluorochroms erforderlich ist.
Dichromatischer Teilerspiegel
Dem Teilerspiegel fällt in der Auflichtfluoreszenzmikroskopie eine
besondere Aufgabe zu. Er muß das Anregungslicht möglichst vollständig
zum Präparat hin reflektieren, während das Fluoreszenzlicht vollst„ndig
durchgelassen werden soll. Filter mit solchen Eigenschaften werden auch
als Reflexions-Kurzpaßfilter bezeichnet oder als dichromatische
Teilerspiegel.
Da von dem dichromatischen Teilerspiegel bestimmte Bereiche eines
Spektrums voll reflektiert werden, während andere voll durchgelassen
werden, ist es möglich, das Anregungslicht vom Fluoreszenzlicht exakt
zu trennen.
Sperrfilter
Das Sperrfilter ist im Abbildungsstrahlengang untergebracht und
soll nur den Wellenlängenbereich hindurchlassen, der spezifisch für das
verwendete Fluorochrom ist. Damit soll alles andere Fluoreszenzlicht
oder gar das vom Präparat reflektierte Anregungslicht vom Beobachter
ferngehalten werden.
Anregungsfilter, dichromatischer Teiler und Sperrfilter müssen für
ein Fluorochrom genau aufeinander abgestimmt sein, wenn optimale
Ergebnisse erzielt werden sollen.
Beispiel: Filterblock FITC
Anregungsfilter: Bandpassfilter 450 nm - 490 nm
Dichromatischer Teiler: Refelexionskurzpaßfilter 510 nm
Sperrfilter Langpassfilter: ab 520 nm
Mikroskop-Optik
Objektive
Ziel ist es stets, helle Fluoreszenzbilder zu erhalten. Hierfür
eignen sich besonders hochaperturige Objektive. Die Apertur eines
Objektivs bestimmt im wesentlichen sein Auflösungsvermögen.
Hochaperturige Objektive sammeln im Durchlicht viel vom Präparat
ausgehendes Licht - im Auflicht konzentrieren sie viel Erregerlicht auf
das Präparat und ergeben somit bessere Fluoreszenzbilder als
niederaperturige Objektive.
Die Helligkeit des Fluoreszenzbildes ist proportional zur vierten Potenz der Objektivapertur.
Schwächere Vergrößerungen ergeben ebenfalls hellere Bilder.
Somit gilt folgende Faustregel:
- Helle Fluoreszenzbilder erzielt man mit schwacher Vergrößerung und hoher Apertur.
- In der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzte Objektive müssen vor
allem UV-Licht und blaues Licht durchlassen und dürfen nur aus solchen
Gläsern bestehen, die keine Eigenfluoreszenz aufweisen.
- Auch Immersionsöl darf keine Eigenfluoreszenz zeigen. Wird
größter Wert auf Fluoreszenzfreiheit gelegt, so empfiehlt sich
Paraffinöl.
- Geringe Eigenfluoreszenz kann im Routinebetrieb normalerweise toleriert werden.
- Luftblasen im Immersionsmittel können zu erheblichen Störungen führen.
Okulare
Starke Okularvergrößerungen führen zu hohen
Gesamtvergrößerungen und damit - wie aus der
Durchlicht-Hellfeldmikroskopie bekannt - zu lichtschwächeren Bildern.
Dies gilt natürlich auch für die Fluoreszenzmikroskopie.
Es sollten daher immer Okulare mit möglichst kleiner Eigenvergrößerung gewählt werden.
Mikroskoptuben
Zum Erzielen möglichst heller Fluoreszenzbilder ist der
Monokulartubus am geeignetsten.
Üblicherweise wird jedoch der Binokulartubus verwendet, der im
Normalfall keine Einschränkungen fordert.
Bei fotografischen Aufnahmen oder bei der Adaption einer Videokamera
wird normalerweise ein Binokulartubus mit Fotoausgang verwendet, bei
dem 30 % des Lichtes zum Betrachter und 70 % zum Fotoausgang geführt
werden. Hier empfiehlt sich immer ein umschaltbarer Tubus mit der
Möglichkeit 100 % des Lichtes zum Auge bzw. zum Fotoausgang lenken zu
können, um extrem lange Belichtungszeiten zu vermeiden.
Primäfluoreszenz des Chlorophylls
Einzellige Alge der Gattung Closterium mit zwei Chloroplasten,
links im Hellfeld, rechts im Fluoreszenzmikroskop
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Einsatz im Bereich der Gewässerökologie
Bei entsprechender Ausstattung kann man im Fluoreszenzmikroskop
einzellige Algen in einem Präparat wesentlich leichter auffinden, als
dies in einem herkömmlichen Mikroskop für die Untersuchung im Hellfeld
möglich wäre.
Flocke aus einem Gewässersediment
Im
Hellfeld ist die Anwesenheit einzelliger Algen bestenfalls zu erahnen.
In der Fluoreszenz fallen diese Organismen dagegen viel stärker durch
die rote Fluoreszenz des Chlorophylls auf. Die zusätzliche gelbliche
Fluoreszenz deutet auf cellulosehaltige Partikel pflanzlichen Ursprungs
in der Flocke hin.
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Hinweis: Es wird deutlich, dass einzellige Algen im
Fluoreszenz-Mikroskop besonders deutlich auffallen. Für ökologische
Untersuchungen in der Limnologie wird deshalb die Primärfluoreszenz von
Chlorophyll häufig zur Bestimmung der Zellzahl kleiner einzelliger
Algen ("autotrophes Picoplankton") genutzt. Man erhält dadurch wichtige
Informationen zum Nährstoffhaushalt eines Gewässers.
Nähere Informationen zum Einsatz der Fluoreszenz-Mikroskopie in der Gewässeruntersuchung:
TÜMPLING,
W.v., FRIEDRICH, G. (Hrsg.) (1999): Methoden der Biologischen
Wasseruntersuchung 2 - Biologische Gewässeruntersuchung. G. Fischer,
Stuttgart, New York.
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© Optische Systeme Jülich GmbH, Bonn
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