Zweifellos gibt es zahlreiche Aufgaben zu lösen, wenn eine Kamera optimal auf ein Mikroskop abgestimmtent werden soll. So stellt sich auch die Frage, welche Vorteile eine moderne digitale Spiegelreflexkamera (DSLR) gegenüber einer Kompaktkamera bietet. Dieser Beitrag will der Frage der Anpassung einer DSLR mittels speziellem Fototubus sowie der Frage nach Optimierung hinsichtlich Sampling, Auflösung und Belichtungszeit nachgehen. Ein wichtiger Unterschied zwischen den früher genutzten, analogen Spiegelreflex-Kameras und einer DSLR ist der Umstand, dass die Bildauflösung fest ist und nicht von der Empfindlichkeit abhängt. So sind bei der Adaptierung von Mikroskop und DSLR grundsätzlich andere Gegebenheiten zu berücksichtigen, als bei einer analogen SLR.
Einführung
Die Frage nach der optimalen Adaption einer digitalen Kompaktkamera hat Herr Müller bereits früher hier im Forum ausführlich beantwortet. Diese Form der Kameraanpassung lässt die Kamera mit der fest eingebauten Optik durch das Okular in das Mikroskop blicken. So übernimmt die Kamera mit Objektiv die Funktion des Auges am Okular. Die Adaption einer digitalen Spiegelreflexkamera oder DSLR (engl.: DSLR = Digital Single Lens Reflex Camera) an ein Mikroskop kann auf zwei Arten erfolgen: Die erste Art entspricht der eben erwähnten Anpassung der Kompaktkamera über Wahl eines geeigneten (Tele-) Objektivs: Die DSLR blickt mit ihrer Optik in ein Okular. Man wird es hier eventuell etwas leichter haben die Anpassung über die Wahl eines Teleobjektivs oder besser Telezoom durchzuführen, da die Objektive der DSLR austauschbar sind. Die weitere Diskussion erfolgt prinzipiell in analoger Weise wie bei der Kompaktkamera und kann bei Herrn Müllers Aufsatz nachgelesen werden.
DSLRs sind größer und schwerer als digitale Kompaktkameras und können daher nicht ohne weiteres von einem Okular getragen werden, so dass diese Art der Adaptierung analog zu den Kompaktkameras mechanisch problematischer erscheint. Ein klassisches Problem dieser Anpassung soll nicht unerwähnt bleiben: Das Unvermögen des Autofokus einer DSLR oder Kompaktkamera, das mikroskopische Bild scharf und vor allem deckungsgleich mit dem Gesehenen im Okular abzubilden. Eine DSLR kann hier Vorteile durch die Möglichkeit der manuellen Fokussierung und einen somit reproduzierbaren Fokus bieten. Ferner entfallen optische Glieder und damit Fehlerquellen der Anpassung.
Adaption einer DSLR mittels Fototubus
Die Möglichkeit DSLRs direkt am (Foto-) Tubus eines Mikroskops einzusetzen ist nicht neu und wird bereits mit analogen Spiegelreflex-Kameras praktiziert. In diesem zweiten Fall der Anpassung einer DSLR übernimmt das Mikroskopobjektiv die primäre Abbildungsfunktion. Die Notwendigkeit ein Okular zu nutzen entfällt ebenso wie das Objektiv der Kamera. Dies gilt sowohl für Endlichoptiken als auch für Unendlichoptiken moderner Mikroskope. Bei letzteren erzeugt eine Tubuslinse wieder ein zugängliches Bild für Okular oder Kamera. Das Bildfeld des Mikroskopobjektivs ist immer auch für das Sichtfeld der verwendeten Okulare ausgelegt und korrigiert. Daher fällt es im Durchmesser eher recht bescheiden aus, wenn man es mit der Fläche des Bilddetektors einer DSLR vergleicht. Am Beispiel eines Zeiss Primo Star soll im Folgenden die Anpassung der Kamera diskutiert werden.
Abbildung: Anpassung der DSLR auf das Mikroskop mit Fototubus (schematisch).
Bei der Adaptierung der DSLR ohne Objektiv sind folgende Probleme zu lösen:
- Korrekte Lage der Bildebene und Planarität des Bildfelds
- Korrekte Größe des Bildfeldes
- Optimierung von Kontrast und Auflösung
- Reduktion verbleibender Farbfehler
Für das Sichtfeld des Primo Stars gibt es Okulare mit den Sichtfeldweiten 18mm und 20mm. Die Mikroskopobjektive des Primo Star sind außerhalb dieser Feldgrößen nicht mehr gut korrigiert. Auch für andere Objektive der größeren Stative von Zeiss gilt ein Sehfeld von max. 23 mm an. Das Gesichtsfeld der Kamera sollte daher besser einen kleineren Ausschnitt des Bildfeldes des jeweiligen Objektivs nutzen, um Abbildungsfehler am Rand des Bildfelds zu vermeiden. Der lichtempfindliche Sensor einer Canon EOS 60D besitzt eine Bilddiagonale von 26.8 mm. Das geforderte Bildfeld für die Kamera wäre also bereits 30% größer als das nutzbare Sehfeld. Eine DSLR mit Vollformatsensor im Kleinbildformat weist eine Bilddiagonale von 43 mm auf. Das ist mehr als das Doppelte des Sehfeldes der Objektive. Daher wird man eine Zwischenoptik benötigen, welche den Abbildungsmaßstab mindestens um den Faktor 1.3x nachvergrößert. Für eine Kamera mit Vollformat-Sensor sollte das Bildfeld mehr als 2x nachvergrößert werden.
Zum Zeiss Primo Star gibt es keine technische Angaben zur realen optischen Auflösung und Korrektur der Optiken für den neugierigen Physiker, welche man den Prospekten entnehmen könnte. Die auf den Objektiven aufgedruckte Zahl NA (=numerische Apertur) kann zwar in eine Auflösung umgerechnet werden. Doch sagt diese Zahl nichts über die tatsächliche Bildqualität aus. Daher muss man überlegen, wie man die Auflösung darstellen kann. Im Falle des Zeiss Primo Star beinhaltet der Fototubus für die DSLR auch eine Optik, welche das Bild um den Faktor 1.6x vergrößert. Es ist hier als (achromatische?) Zerstreuungslinse realisiert, deren Aufgabe es ist, das Bild weiter nach außen zu verlegen, um das Gehäuse der DSLR besser an den Flansch anzupassen und den Abbildungsmaßstab 1.6x zu vergrößern. Die Bildebene stimmt für die verwendete Canon EOS 60D und einen früher erworbenen T2 Adapter überraschend gut mit der Schärfeebene des Okulars überein, was die Handhabung sehr vereinfacht.
Es sei angemerkt, dass die Schnittweite des erforderlichen T2-Adapters, mit dem die Canon Kamera am Mikroskop Adapter des Primo Star angebracht ist, ebenfalls wichtig ist, um Bildebene von Kamera und Okular in Einklang zu bringen. Es gibt mechanisch schlecht ausgeführte T2-Adapter im Handel, die zwar irgendwie von Canon Bajonett nach T2-Gewinde umsetzen, das Abstandsmaß jedoch nicht berücksichtigen. Der schlechteste Fall, den ich erwarb, war ein T2-Adapter, der nicht einmal einrastete, sondern im Bajonett der Kamera frei drehbar war. Mit solch schlechter Mechanik besteht sogar die Gefahr der Zerstörung des Bajonetts und der darin erhaltenen elektronischen Komponenten einer modernen DSLR. Hier gilt also: nicht am falschen Ende sparen.
Der genannte Zeiss Fototubus 1.6x ist nur für Kameras mit kleinem Sensorformat geeignet, da die Nachvergrößerung nicht den Anforderungen eines Vollformatsensors entspricht. Das ist jedoch kein Beinbruch, denn die Auflösung des Systems ist begrenzt, wie wir gleich sehen werden. Daher ist eine Vollformatkamera hier kaum noch sinnvoll einzusetzen. Waren vor einigen Jahren noch Rauschgrößen und Empfindlichkeit gelegentlich ein Kaufargument für eine teurere Vollformatkamera, kann man bei aktuellen Modellen der Kamerahersteller praktisch keine praxisrelevanten Unterschiede der Rauschgrößen messen. Die CMOS Sensoren heutiger DSLRs sind in einen Bereich vorgedrungen, in dem das Eigenrauschen der Kamera praktisch in der Größenordnung einer CCD-Kamera liegen kann. DSLR Kameras bieten vor allem und bedingt durch das Konstruktionsprinzip der CMOS Bildsensoren in puncto Auslesegeschwindigkeit und Rauschen sogar Vorteile gegenüber den traditionellen CCDs.
Abbildung: Das verwendete Zeiss Primo Star mit Fototubus 1,6x und Canon EOS 60D
Bemerkungen zur Bildauflösung
Beim Lichtmikroskop blickt man gewöhnlich mit dem Auge durch das Mikroskop und macht sich eventuell auch ein Bild vom Gesehenen. So besehen ist die Kamera das zweitrangige Accessoire am visuell genutzten Mikroskop. Daher erwirbt man niemals ein optimal auf die Fotografie abgestimmtes Gerät, sondern nur ein solches das optimal für das Auge ist und auch die Möglichkeit bietet, Fotos oder Videos zu erstellen. Das fängt bereits bei der Auswahl der Objektive, ihrer Abstimmung und Kenngrößen an. Und es endet damit, dass das Bild der Kamera eben genau das Gesehene reproduziert und nicht eine primäre Forderung an ein optimales Foto erfüllt. Es ist durchaus gewöhnungsbedürftig digitale Mikrofotos mit bestmöglicher Auflösung mit dem Gesehenen im Okular zu vergleichen oder das Gesehene so zu interpretieren, dass man auf das Ergebnis im resultierenden Foto schließen kann. Mikrofotos geben ungeschönt alles wieder, doch scheinen sie irgendwie nur einen Teil des gesehenen Bildes wieder zu geben und andere Teile besser. Der Rest unterliegt der Illusion und Selektion unseres Gehirn beim Blick durchs Okular. Was eine Kamera jedoch auch tut: sie gibt eben nur das wieder, was auch für das Auge zu sehen war. Nicht mehr und nicht weniger. Gelegentlich meint man im anschließenden Foto weniger zu erkennen, als beim Blick durchs Okular. In diesem Moment merkt man, dass man bereits einer optischen Täuschung erlag. Doch, wie bestimmt man nun die Bildauflösung eigentlich?
Die folgenden Messungen und Rechnungen sind gedacht, um eine optimale Adaption mit jedem anderen Mikroskop nachvollziehen zu können. Da ich jedoch augenblicklich nur dieses eine Mikroskop zur Hand habe, bleibt das Zeiss Primo Star eben der Star der folgenden Diskussion. Grundsätzlich sind folgende Fragen zu klären:
1. Wie bestimmt man die Auflösung des Mikroskop?
2. Wie kann man den Abbildungsmassstab des Mikroskops bestimmen?
Zur Beantwortung von Frage 1) ist zu bemerken, dass es keine verlässliche Methode zur Bestimmung des tatsächlichen Auflösungsvermögens eines Mikroskops geben wird, welche mit vertretbarem Aufwand umzusetzen wäre und welche dem späteren Bildeindruck gerecht wird. Dies steht zweifellos im Widerspruch zu den vertrauten Angaben der Herstellerbroschüren und den Formeln aus dem Lehrbuch der Optik. Streng genommen ist die Fragestellung, die Auflösung eines Mikroskops zu bestimmen, ein schlecht gestelltes Problem. Weswegen eigentlich keine gute Lösung existiert. Doch es kommt noch dicker.
Die Aussage einer bestimmten vorgefundenen Auflösung in der Mikroskopie kann insofern auch nicht als stichhaltig gelten, als immer ein gewisser Aufwand getrieben wird, die Kontrastverhältnisse eines Bildes zu beeinflussen und zu verändern. Dies verändert auch die lokale Auflösung im erhaltenen Bild - nun sogar in Abhängigkeit vom beobachteten (Phasen-) Objekt. Die Ergebnisse von Beleuchtungsverfahren, wie schiefer Beleuchtung, Phasenkontrast oder DIK sind hochgradig subjektiv auf Physiologie und Sehvermögen des Menschen abgestimmt. Die physikalischen Hintergründe der Beleuchtungsverfahren sind alles andere, als linear. So muss man wohl feststellen, dass es für jedes beobachtete Objekt leider auch eine individuelle Beobachtungsmethode mit unterschiedlichem Ausgang bei der erhaltenen Bildauflösung geben wird. An dieser Stelle rede ich noch nicht einmal von bildverbessernden (oder verschlechternden), digitalen Verfahren. Gar wurden bereits verschiedene optische und digitale Verfahren zur mikroskopischen Super-Resolution veröffentlicht, auf die ich hier nicht näher eingehen will. So sind die Ergebnisse zweier Beobachtungen hinsichtlich erhaltener Auflösung kaum seriös vergleichbar und noch schlechter reproduzierbar. Am ehesten wird man noch einzelne Pixel diskutieren müssen.
Wer nun meint, dass die Physik doch klare Regeln bezüglich der Grenzauflösung habe, der irrt. Es existieren mehrere Kriterien zur Bestimmung einer Auflösungsgrenze in der Physik, wie etwa die Definitionen des Rayleigh oder Dawes Kriterium. Dennoch kann nicht davon ausgegangen werden, dass eines dieser Kriterien prinzipiell richtig wäre. Den Dekker & Van den Bos (1997) [3] erläutern dann dem erstaunten Physiker und Mikroskopiker obendrein, dass auch das Rayleigh Kriterium zur Auflösungsgrenze, wie alle Definitionen, lediglich willkürlich festgelegt ist. Nachdem dieser Schock verdaut ist, man hat es ja schließlich schon immer gewusst, stellen diese Definitionen folglich keine echte oder gar unüberwindbare, physikalische Grenze der optischen Auflösung dar. Die Auflösungsgrenze ist zudem abhängig von der Wellenlänge des Lichts. Damit besteht hier bereits eine große Unsicherheit über eine erzielbare Auflösung im beobachteten Spektralbereich im Falle inkohärenten Lichts. Obendrein beziehen sich einige Definitionen, wie das Dawes Kriterium auch darauf, ob der Mensch ein erzeugtes Abbild mit dem Auge noch trennen kann. Sie entstammen also eher einer interdisziplinären Untersuchung mit einer physiologischen, jedoch keiner physikalischen Bewertung. Ironischer Weise liefert das Dawes Kriterium sogar eine höhere Auflösung einer Optik, als die physikalische Definition des Rayleigh Kriteriums.
Ernst Abbe dürfte sich im Grabe umdrehen beim Ausmalen der Konsequenzen dieser Debatte. Doch hilft es nichts, auch in der Physik dreht sich die Welt weiter. Der Hersteller von Mikroskopen wird sich weiterhin an der subjektiven Begutachtung durch den Betrachters messen lassen müssen. Hier helfen nur selbst gesteckte Ziele und Qualitätskriterien. Hoch leben also Abbe und Rayleigh, denn sie haben ihre Daseinsberechtigung sicherlich nicht verloren, nur weil die Behauptung es gäbe eine Auflösungsgrenze, nicht richtig ist. Ganz im Gegenteil. Wichtig bleiben dennoch die realen Fehler der Abbildung, welche der Hersteller durch Sorgfalt bei der Herstellung der Optik minimieren wird. Daher beschränke ich mich zur Beantwortung von Frage 1) später auf die Diskussion von Anschauungsmaterial, welches sich aus Fotos einer Bakterienkolonie eines Erd-Aufgusses ergab. Der Leser mag im Glauben dennoch gerne an seiner individuellen Lieblings-, Auflösungs- oder Beugungs-Grenze festhalten. Es ist jedoch müßig darum zu streiten.
Bestimmung des Abbildungsmaßstabs
Der Einsteiger in die Mikrofotografie wird ziemlich früh (oder später) auch die Erfahrung machen, dass die geringeren Vergrößerungen (z.B. 4x und 10x) auf den ersten Blick schärfere Bilder zu ergeben scheinen, als die hohen Vergrößerungen zwischen 40x und 100x. Was ist der Grund für diese Beobachtung?
Die zweite der oben gestellten Fragen ist für den Mikroskopiker schon erheblich leichter zu beantworten. Der Abbildungsmassstab kann vermessen werden, indem man ein spezielles Mikropräparat nutzt, das beispielsweise einen Millimeter mit 100 Teilen zur Verfügung stellt. Ein solches Präparat wurde für die einfache Bestimmung des Abbildungsmaßstabs genutzt. Die Bilder vom Präparat wurden mit einer Canon EOS 60D gewonnen, welche mittels des Zeiss DSLR Adapter x1,6 auf dem Primo Star befestigt ist. Mit folgenden Primo Objektiven wurden Bilder für die folgende Tabelle gewonnen: 4x/0.1, 10x/0.25, 40x/0.65 Ph2 sowie das 100x/1.25 Ph3. Bei den Phasenkontrast-Objektiven wertete ich sowohl Aufnahmen im Hellfeld, als auch im Phasenkontrast vom Präparat aus. Die Abbildungen des Präparats wurden sowohl im Canon RAW Modus als Einzelbild vermessen, als auch im Videomodus. Es interessierte mich hierbei auch, von welcher Qualität Videoaufnahmen sein würden. Aus dem Unterschied zwischen den hoch aufgelösten RAW Fotos und den Videoaufnahmen in der Qualität Full HD (1080p bei 1920x1080 Pixel) ergibt sich für die EOS 60D eine theoretische Pixeldimension von 11.6 µm für das Videoformat und 8.6 (4.3) µm für die Einzelbilder. Der in Klammern gesetzte Wert ist die Größe der einzelnen lichtempfindlichen Farbpixel des Bildsensors. Diese Werte wurden aus dem Hersteller Datenblatt [1] zur Canon in Mikrometern ermittelt (Breite des Sensors geteilt durch Anzahl der Pixel im Foto). Daher können sie eventuell geringfügig abweichen. Der Leser wird bemerkt haben, dass ich den Begriff Pixelgröße vermeide. Grund ist, dass der Begriff am ehesten noch einen Abstand zwischen Pixeln charakterisiert und durch vielerlei digitale Bearbeitung verwässert wird. Richtig ist jedoch, dass ein Pixel immer eine lichtempfindliche Fläche eines Detektors repräsentiert, was vielerlei Konsequenzen für die richtige Deutung von Bildsignalen haben wird.
Die folgende Tabelle gibt die Verhältnisse für die gemessenen Objektive mit dem Zeiss Primo Star, Canon EOS 60D und dem Zeiss Fototubus 1,6x wieder:
Objektiv NA µm/pix Vergr. theor. Aufl. Sampling
Plan Achromat 4x 0.10 1,82 6,4x 2,75 µm 1,5
Plan Achromat 10x 0.25 0,72 16,1x 1,10 µm 1,5
Plan Achromat 40x Ph 0.65 0,18 64,5x 0,42 µm 2,3
Plan Achromat 100x Ph 1.25 0,07 163,6x 0,22 µm 3,1
Tabelle: Ermittelte Vergrößerungen und Sampling für das Zeiss Primo Star für Full HD Video (1920x1080 Pixel).
Die erste Spalte benennt die verwendeten Objektive nebst Vergrößerung. Die zweite Spalte enthält die eingravierte numerische Apertur der Objektive. Die dritte Spalte benennt den mit dem Messpräparat bestimmten Abbildungsmassstab. Für die Messung spielt die Pixeldimension der Kamera aus dem Datenblatt keine Rolle. Der Wert ergibt sich durch Ausmessen (Zählung) der Pixel pro gemessener Einheit auf dem Präparat, z.B. als die Anzahl der Pixel zwischen den Strichen der 0,3 mm und 0,5 mm Marken des Präparats im erhaltenen Foto. Die vierte Spalte ist die aus der Pixeldimension der Kamera erhaltene Gesamtvergrößerung einschließlich der Nachvergrößerung durch den Kamera Adapter 1,6x. Die in der fünften Spalte enthaltene theoretische Auflösung ergibt sich aus der zu den Objektiven angegebenen numerischen Apertur (NA) für grünes Licht (550 nm) aus der Formel
A = l / (2 NA)
wobei A die Auflösung des Bildes in µm ist, l die Lichtwellenlänge µm ist (in der Rechnung 0,550 µm für gelbgrünes Licht), und NA der Wert der numerischen Apertur. Die sechste Spalte gibt schließlich an, wie viele Pixel der Breite des Beugungsmaximum einer theoretisch abgebildeten Punktlichtquelle entsprechen würden. Man spricht hierbei auch vom Sampling der erhaltenen Aufnahmen. Der Begriff wird im Folgenden noch diskutiert. Die erhaltenen Vergrößerungswerte der Bilder auf dem Kamerasensor stimmen gut mit den Herstellerangaben überein. Wie man sieht, steigt die theoretische Auflösung nicht in gleichem Maß wie die Vergrößerung der Objektive. Stattdessen nimmt die Überauflösung für die hoch vergrößernden Objektive stärker zu. Wir verwenden hier zwar doch eine theoretisch errechnete Auflösung, jedoch nur als Vergleich zur Abschätzung und Optimierung des Abbildungsmaßstabs.
Auflösung anschaulich
Im Falle des Zeiss Mikroskops mitsamt dem Fototubus ergibt sich aus der Tabelle, dass in der Kombination mit der Canon Kamera Videobilder in Full HD Bilder nahe dem Fall optimalen Samplings ergeben werden, welcher dem Wert 2 entspräche. Dies wird auch deutlich, wenn man sich entsprechende Aufnahmen im Detail ansieht. Vorbereitend wurde das Mikroskop nach dem ersten Aufbau vorschriftsmäßig vorbereitet. Dies umfasste Staubentfernung bei Objektiv, Kondensor und Beleuchtung, und erforderte die korrekte Zentrierung von Kondensor und dem Phasenkontrast Schieber Ph2. Besonders erfreulich ist hierbei die mitgelieferte Anleitung. Lediglich ein Einstellfernrohr vermisse ich.
Abbildung: Bakterienkolonie mit Kleinamoebe mit 40x Ph Objektiv im Phasenkontrast (Ausschnitt), zur Ansicht in Originalauflösung den Link
Bakterien-gross öffnen.
Die obige Abbildung zeigt ein Standbild aus einer HD Videosequenz, welche mit dem Zeiss Primo 40x Ph2 Objektiv aus einem Lebendpräparat mittels Phasenkontrast gewonnen wurde. Beim Präparat handelt es sich um einen Tropfen aus einem Erdaufguss, welcher mit Milchtropfen gefüttert wird. Der Klassiker, um Augentierchen oder Wimpertierchen, wie das Pantoffeltierchen zu ziehen. Zu Beginn der Kultur Anfang finden sich eine ganze Menge Bakterien und kleine Amöben ein, die mir zum Auflösungstest gerade willkommen erschienen. Im Bild sind zwei Regionen markiert. Diese sind rechts 4x vergrößert als Ausschnitt angefügt, um die Pixelstrukturen besser sichtbar zu machen. In der Vergrößerung erkennt man die Abmessungen winziger Zellorganellen der kleinen Amöbe (Ausschnitt 1). Die abgebildeten Bakterien weisen durchaus noch erkennbare Details im Bereich der Pixeldimension auf (Ausschnitt 2). Jedes Pixel entspricht einer Struktur, welche nur 0,18 µm klein ist. Diese Dimension entspricht weniger als der Hälfte der Lichtwellenlänge des gelbgrünen Lichts (550nm). An der Grenze dessen, was Lichtmikroskope optisch leisten können, entspricht die erhaltene Auflösung jedoch nur der halben Auflösung dessen was mit dem 100x Ph3 Objektiv möglich wäre. Ich habe jedoch verzichtet dieses zu demonstrieren, da eine Ölimmersion auf einem schwimmenden Deckglas eines Lebenpräparats für denjenigen, der mein Experiment einfach nachvollziehen soll, eine echte Zumutung hinsichtlich Präparationskunst und Beobachtung mit dem Mikroskop darstellt. Der Leser soll das Gelesene ja einfach nachvollziehen können. Durch Abzählen der Pixel in den Ausschnitten erhält man nun, dass Theorie und Praxis der Bildauflösung recht gut überein stimmen.
Abbildung: Unbekanntes Objekt mit Plasmafaden (Ausschnitt), zur Ansicht in Originalauflösung den Link
Plasmafaeden-groß öffnen.
Auf eine ausführliche Diskussion zur Bildentstehung des Phasenkontrasts und der Wiedergabe der optischen Auflösung möchte ich jedoch verzichten. Man erahnt jedoch bereits die Schwierigkeiten Auflösung und Kontrast in einem solchen Bild richtig zu deuten, da man bereits meint, überaufgelöste Details im Phasenkontrastbild gefunden zu haben. Die zweite Aufnahme aus dem gleichen Präparat zeigt ein Standbild aus einer HD Videosequenz eines mir bis dato unbekanntes Phänomen, bei dem zwei Objekte durch einen extrem dünnen Plasmafaden verbunden sind. Dessen Dicke scheint unterhalb des optischen Auflösungsvermögens des Mikroskopszu liegen und ist dennoch im Phasenkontrast erkennbar. Diese seltsamen Objekte ähneln denen größerer geplatzter Zellen, deren freigesetzte Organellen anschließend frei schwimmend durch Plasmafäden verbunden sind. Ich fand zwei ähnliche dieser Objekte im Präparat, ohne Gewissheit zu haben, um was es sich hier handeln könnte.
Sampling und Abbildung
Wie auch bei der Anpassung einer Kamera an ein astronomisches Fernrohr gilt auch für das Mikroskop, dass eine Kamera von der Pixelauflösung her nicht überdimensioniert sein sollte, wenn die Bilder optimal belichtet und scharf abgebildet sein sollen. Die optimale Anpassung der Kamera ist theoretisch dann erzielt, wenn die Breite des Hauptmaximums der Beugungsfigur einer Punktlichtquelle 2 Pixel auf dem Bild entspricht. Dies ist der Fall optimalem Samplings nach Nyquist [4]. Dies ist in der Tabelle in Spalte 6 ausgedrückt. Für die beiden niedrig vergrößernden Optiken (4x, 10x) ergibt sich aus der Tabelle ein leichtes Undersampling für die gewählte Videoauflösung. Der Bildeindruck erscheint mit diesen beiden Vergrößerungen subjektiv schärfer, da durch Undersampling auch eine gewisse Unschärfe unterdrückt wird. Für die hohen Vergrößerungen gilt: Sie sind ebenfalls fast optimal belichtet, bieten jedoch etwas überhöhte Auflösung. Für das höchst vergrößernde 100x Ph Objektiv ist der Wert für optimales Sampling des Mikroskopbildes mit 3,1 Pixel bereits deutlich überschritten, d.h. 1,5x over-sampled. Das gilt im Grunde auch für die visuelle Beobachtung. Der Betrachter wird unter bestimmten Umständen jedoch visuell andere Kontrastverhältnisse vorfinden und anders bewerten, als die Kamera. Wäre man in der Lage die Auflösung der Kamera zu reduzieren, könnte man diesen Umstand beheben, indem man eine Pixelauflösung wählt, die nur 2/3 des Werts entspricht. Auch bei der visuellen Beobachtung stellt man gelegentlich fest, dass die Wahl eine 63x Objektivs ein kontrastreicheres Bild bietet. Doch bieten kontrastierende Verfahren, wie wir anhand der Abbildungen sehen, eben auch eine punktuell "höhere Auflösung" so dass geringes Oversampling im Grenzfall durchaus gerechtfertigt erscheint. Vergleicht man die volle, mögliche (jedoch interpolierte) Bildauflösung (5.184x3.456) der Canon Kamera mit der Auflösung ihrer hoch aufgelösten Videobilder in HD Qualität (1920x1080) so findet man, dass die Wahl voller Kameraauflösung der Fotos weniger gut geeignet sein kann, gute Bilder mit einem Mikroskop zu erstellen. Es muss hier darauf hingewiesen werden, dass sich eine gewisse Unsicherheit bezüglich der Bestimmung von Pixeldimension ergibt. Der geneigte Leser wird es längst erahnt haben: Das Verhältnis aus maximal verfügbarer Anzahl der Farbpixel des Sensors zur möglichen Videoauflösung steht in keinem ganzzahligen Verhältnis, sondern ergibt den Wert 5184/1920 = 2.7. So muss man annehmen, die von der Kamera herunter gerechneten Aufnahmen würden zwangsläufig irgendwie berechneten Bildwerten entsprechen. Dies hat gewisse Auswirkungen auf Rauschgrößen und tatsächliche Auflösung im digitalen Bild bei reduzierten Auflösungen, auf die ich hier jedoch nicht näher eingehen möchte. Nun wird auch dies klar: Die Wahl einer Vollformat DSLR würde keinen Vorteil bezüglich einer zu erwartenden besseren Bildauflösung bieten. Eher dürfte man das Problem haben, keinen geeigneten Fototubus im Zeiss Katalog zu finden.
Belichtung der Bilder
Die verwendete Canon EOS 60D bietet eine Dynamik von 14 Bit pro Farbkanal. Die einstellbaren ISO Zahlen reichen bis 6400. Die besten Filmemulsionen mit denen man früher Farbaufnahmen erstellen konnte, boten bestenfalls 800 ASA (800 ISO, entspricht 27 DIN) und hatten eine grobe Körnigkeit des Films zur Folge. Die neueren ISO Zahlen digitaler Kameras basieren auf Varianten des Verstärkungsfaktors der Elektronik nach der ISO Norm 12232:2006 [5]. Für die Nutzer von CCD Kameras sei hier angemerkt, dass hohe ISO Zahlen der DSLRs über 400 ISO offenbar bereits leere Verstärkungen in der Kamera bedeuten. Dies sind Werte, die Messungen aus der Amateurastronomie entnommen sind. So beschreibt Christian Buil [1], dass einige der von ihm gemessenen 14 Bit Canon Kameras bei 400 ISO bereits eine Verstärkung bieten, die einem Lichtquant pro gemessener Graustufe entspricht. Höhere, gewählte Einstellungen als 400 ISO führen hier also bereits zu Leerverstärkung ohne Lichtgewinn. Der Sinn solcher Übertreibungen bei ISO Einstellungen liegt jedoch nicht darin, den Verbraucher zu verwirren, sondern unterbelichtete Aufnahmen in einen Bereich zu befördern, in dem sie wieder brauchbare Helligkeiten für den begrenzten Helligkeitsumfang einer Videoaufnahme oder eines JPEG Bildes bieten. Für RAW Aufnahmen erscheinen 400 ISO ausreichend und optimal, sofern für die spätere Verarbeitung eine geeignete Software vorhanden ist, die mit den dunklen Bereichen im Bild gut umgehen kann. Nach meiner Erfahrung ist sogar Photoshop überfordert mit diesen Grenzhelligkeiten im RAW Bild, insbesondere, wenn beim Laden Farbraumkonversionen berechnet sind. Daher machen übertriebene ISO Einstellungen in der späteren Bearbeitung durchaus Sinn, auch wenn sie praktisch nur das vorhandene Rauschen verstärken. Der Videomodus der Canon bietet eine gute Automatik der ISO Zahl um ein gleichmäßig belichtetes Bild auch bei knappen Einzelbelichtungen zu liefern.
Bei bewegten Bildern von Wimpern oder Geißeln einzelner, schnell schwimmender Protozoen ist die Auflösung stark von der zeitlichen Auflösung der Aufnahme abhängig. Generell ist der Anwendungsfall in der Mikroskopie ein anderer, als in der Astronomie, weswegen in der Mikroskopie generell angeraten ist, die Belichtungszeit ohne Rücksicht auf die ISO Zahl so zu wählen, so dass die Bilder hinsichtlich der Bewegung scharf bleiben. Daher sollte man schrittweise die Belichtungszeit verkürzen, bis man auf dem Kamera Display erkennt, dass sich das Bild verdunkelt. Ab diesem Punkt hat man die Wahl, noch kürzer zu belichten, um Die Bewegung einzufrieren oder die Belichtungszeit wieder zu verlängern, um das erhaltene Rauschen zu reduzieren, was Bewegungen unscharf werden lässt. Bei Videoaufnahmen stört höheres Rauschen vom Bildeindruck her meist nur in technischer Hinsicht. Etwa dann, wenn geplant ist, die Videos stärker zu komprimieren. Der Unterschied im Rauschen zwischen einem Video mit Belichtung von 1/30s und einem solchen, das mit Belichtungszeiten von 1/500s im Phasenkontrast gewonnen wurde, wird jedoch rasch praktisch unüberwindbare Grenzen aufzeigen. Diese Grenze ist sicherlich weniger umstritten, als die Auflösungsgrenze. Denn die Lichtmenge ist durch die Quantennatur des Lichts begrenzt. Fehlendes Licht in Form seiner Quantennatur kann auch durch elektronische Verstärkung nicht mehr zurück erhalten werden. So kratzen moderne DSLRs hinsichtlich des Lichtsammelvermögens praktisch heute schon fast an der Grenze dessen, was man auch künftig noch von mikroskopischen Entwicklungen in der Kameratechnik erwarten kann. Dennoch muss man festhalten: Mit chemischen Filmen waren so kurz belichtete Aufnahmen im Phasenkontrast bereits extrem schwierig und oft wenig befriedigend. Weswegen mit der analogen SLR stets geblitzt wird. Videoaufnahmen sind auf diese Weise natürlich unmöglich und müssen mit einer kontinuierlichen Lichtquelle getätigt werden.
Die Lichtmenge zur Fotografie ist auch heute noch ein Problem bei der Beobachtung empfindlicher Lebewesen. Da man mit dem Auge bei niedriger Mikroskopvergrößerung schon Schmerz empfindet und die Beleuchtung freiwillig herunterregelt, kann man sich sprichwörtlich vor Augen führen, dass die Köhler'sche Beleuchtung eines solchen Mikroskops wie dem Primo Star für die beobachteten Objekte unter dem Mikroskop extreme Beleuchtungsstärken bedeutet, wie sie in der Natur so nicht vorkommen. Wenn man einmal das Gefühl hat, der Phasenkontrast im Bild ließe nach, kann es durchaus sein, dass das Objektiv beschlagen ist, weil das intensiv durchleuchtete Präparat am Rand rascher verdunstet, als man denkt.
Das mechanische Problem der Bildauslösung kann bei der DSLR mit Spiegelvorauslösung behoben werden. Bei der Videoaufzeichnung bieten einige Kameras heute einen Live View, bei dem der Spiegel auch zwischen den Aufnahmen permanent hochgeklappt bleiben kann. Dennoch ist der Schalter für die Auslösung einer Videosequenz bei der EOS 60D etwas unpraktisch konzipiert und kann nicht über den Fernauslöser bedient werden. Die meisten Erschütterungen werden erfahrungsgemäß jedoch durch den instabilen Labortisch, den Fokustrieb oder Kreuzschlitten bei der Bedienung des Mikroskops während der Videoaufnahme entstehen. Die Zeit bis zum Abklingen eines solchen Schwingend betrug in meinem Fall meist nur ein, zwei Sekunden. Diese Zeit ist zur Länge der geplanten Videosequenz hinzuzurechnen und kann später digital herausgeschnitten werden.
Schlußbemerkungen
Es sollen keine Folgerungen über die Qualität des Mikroskops aus den Messungen und Abbildungen gezogen werden. Mikroskop und Kamera waren im Beispiel willkürlich gewählt, um darzustellen, wie die eine Kamera optimal an das andere Mikroskop angepasst werden kann. Der geneigte Leser mag die Aufnahmen gerne mit denen anderer Mikroskope vergleichen und sich selbst ein Urteil bilden. Diese Adaptierung einer DSLR hängt freilich auch von den Gegebenheiten der Kamera ab. Die Pixelauflösung der Kamera ist nicht unbegrenzt frei wählbar. Das Angebot der Hersteller an verfügbaren Adaptern ist stets begrenzt und marktorientiert. Praktische Faktoren begrenzen mitunter die Einsatzmöglichkeit einer teureren Vollformat DSLR. Grundsätzlich wichtig ist die Kenntnis des Verhältnisses zwischen der ermittelten Pixelauflösung (Spalte 2, in Einheiten von µm/pix) und theoretischer Auflösung auf dem Sensor (in Einheiten von µm, berechnet aus der numerischen Appretur). Aus dem optimalen Sampling für die jeweilige Kamera ergibt sich dann die optimale Bildauflösung in Pixel. Anhand der diskutierten Werte für Abbildungsmaßstab und Pixeldimension der Canon EOS 60D in Verbindung mit dem Zeiss Primo Star wurde gezeigt, dass der Zeiss Fototubus 1,6x eine optimale Anpassung für Videoauflösungen in Full HD Qualität (1920x1080) bietet.
Da die Bildauflösung einer Kamera nicht frei wählbar ist, sollte man in der Regel für die Fotografie diejenige Bildauflösung wählen, für welche das Sampling gerade übererfüllt ist. Für Einzelbilder in RAW Qualität sollte man die höchste Auflösung speichern und die erhaltenen Bilder mit einem Programm weiter bearbeiten, das die halbe, tatsächliche Bildauflösung der Farbpixel verarbeitet. Der Grund ist, dass die vom Kamerahersteller erzielte höchste Auflösung nur synthetisch hergestellt wird und die Lücken zwischen den Farbpixel solcher Bildsensoren mit Bayer-Matrix (wie etwa bei der Canon) mit einem bestimmten Algorithmus durch Interpolation geraten und hinzugefügt werden. Die Weiterverarbeitung solch interpolierter Bilder hat zumeist negative Auswirkungen auf Bildauflösung und Rauschen [6]. Im hochaufgelösten RAW Bild liegen andererseits alle Detektor-Informationen für jedes Farbpixel einzeln vor, so dass ein solches Farbbild einem unverfälschten Bild der halben Detektor-Farbauflösung entspricht. Im Falle des verwendeten Gespanns aus Primo Star und Canon EOS 60D ist diese halbe Bildauflösung nicht weit vom Optimum entfernt. Weiterhin halbierte Bildauflösung würde u.U. Detailverlust bedeuten. Unter der Annahme, dass die von den Herstellern angegebenen Daten in den Broschüren der Mikroskope tatsächlich erfüllt sind, lassen sich die Werte der Tabelle näherungsweise auch anhand der Herstellerprospekte abschätzen. Angesichts unterschiedlicher Beobachtungstechniken (z.B. Hellfeld, Dunkelfeld, Phasenkontrast) wird die Bewertung der Bildqualität des Mikroskops letztlich auch vom beobachteten Objekt abhängen, dem Zustand der Optik, der Dicke des verwendeten Deckglases und verschiedener anderer Gegebenheiten. Unberücksichtigt bleiben bei einer solchen Abschätzung immer Serienstreuung und Qualität der Mikroskope.
Ob die Wahl letztlich nun auf ein CCD oder eine DSLR fallen wird, ist eine Frage des Anwendungsfalls, verfügbarer Software, eine Frage der Kosten und sprichwörtlich wohl auch Ansichtssache. Nach meiner Erfahrung mit DSLRs in der Astronomie bieten moderne CMOS Bildsensoren heute eine Bildqualität, die derjenigen erheblich teurerer CCD Spezialkameras durchaus ebenbürtig scheint. Immerhin können auch die besten CCDs keine Lichtquanten erfinden, die nicht den Bildsensor erreicht haben. Das schon, weil es auch den Satz der Energieerhaltung gibt, welcher ein Perpetuum Mobile verbietet. Die Überlegungen hinsichtlich optimaler Bildauflösung hingegen sind auf die optimale Anpassung einer CCD Kamera ebenso anzuwenden.
Literatur
[1] Buil, C., Utilisation du Canon EOS 40D pour l'imagerie faible flux, http:// astrosurf.com/buil/eos40d/test.htm, last visited December 2012
[2] Canon EOS 60D, Technische Daten, Canon Website.
[3] Den Dekker, AJ and Van den Bos, A., 1997. Resolution: A Survey. Journal of the Optical Society of America A, vol. 14, no.3, p.547-557
[4] Nyquist, H., 1928. Certain Topics in Telegraph Transmission Theory. Transactions of the Institute of Electrical Engineers.
[5] British Standards Institute Staff, 2006. Photography. Digital Still Cameras. Determination of Exposure Index, ISO Speed Ratings, Standard Output Sensitivity, and Recommended Exposure Index, ISBN 9780580483356
[6] Bauer, Thilo. The RAW Image File Format Problem - Applications of Digital SLR Cameras in Astronomy and Science. Proceedings of the 4th Annual Meeting on Information Technology & Computer Science at the BA-University of Cooperative Education, H. Weghorn (Ed.), Stuttgart, ISSN 1614-2519, February 2008
9-mal bearbeitet. Zuletzt am 03.01.13 01:28.
