In unserem Bonner Arbeitskreis Mikroskopie behandeln wir sehr ausführlich Färbungen von botanischen Schnitten in Workshops. Nach dem wir zwischenzeitlich schon einige Erfahrungen mit Simultan- und Mehrfachfärbungen und deren Handhabung durch Teilnehmer gemacht haben, habe ich eine Mehrfachfärbung mit folgende Eigenschaften vorbereitet:
- Klare Abgrenzung von lignifizierten (verholzten) und nicht-lignifizierten Zellwänden.
- Weitgehende farbliche Differenzierung mit Rot-, Blau-, Grün- und Gelbtönen.
- Das Ergebnis soll nachvollziehbar mit Darstellung in Lehrbüchern sein.
- Jeder Arbeitsschritt muss für sich im Hinblick auf das zu erreichende Endergebnis einschätzbar und beurteilbar sein.
- Die Färbung soll verschiedene grundlegende Färbetechniken enthalten, wie zum Beispiel simultane Färbung, sukzedane Färbung, spezifische Anfärbung, Differenzierung.
- Alle Teilnehmer sollen ein selbstgefärbtes und im Ergebnis vergleichbares Dauerpräparat herstellen können.
- Optionen für individuelle Varianten und eigene Weiterentwicklung.
- Die Färbung soll einfach nur schön aussehen.
Hierfür habe ich die hinreichend bekannten Färbungen Safranin-Astrablau, Etzold FSA, Etzold FCA und Wacker zu einer Mehrfachfärbung kombiniert. Sie erfolgt in drei Färbeschritten:
Erste Färbung
Vorfärbung mit Safranin / Diamantfuchsin. Man kann auch auf Diamantfuchsin verzichten. Bei den nachfolgenden Arbeitsschritten verhält sich Diamantfuchsin ähnlich wie Safranin. Ich es aber zur Unterstützung der Anfärbung von lignifizierten Zellwänden hinzu genommen.
Farblösung: 1 g Safranin + 0,1 g Diamantfuchsin auf 100 ml destilliertes Wasser.
Differenzierung
Der Schnitt ist stark überfärbt. In Salzsäurealkohol wird die Färbung bis auf Anfärbung von lignifizierten Zellwänden ausgezogen.
Lösung: 100 ml 70% Ethanol + 0,5 ml Salzsäure (HCl).
Zweite Färbung
Simultane Färbung mit Astrablau / Acrflavin. Diese Farbgemisch färbt differenziert nicht-liginifizierte Zellwände in Gün- und Blautöne.
Farblösung: 0,5 g Astrablau + 0,5 g Acriflavin auf 100 ml destilliertes Wasser.
Dritte Färbung
Nachfärbung mit Chrysoidin. Dieser Farbstoff färbt selektiv stärker lignifizierte Zellwände und unterstützt somit noch die Vorfärbung. Darüber hinaus wird die Cuticula spezifisch angefärbt.
Farblösung: 0,03 g Chrysoidin auf 100 ml destilliertes Wasser.
Die Farblösungen habe ich aus meinen bevorrateten Stammlösungen angesetzt. Die genauen Konzentrationen sind aber unkritisch. Besonders Astrablau / Acriflavin und Chrysoidin kann noch weitaus mehr verdünnt werden. Man könnte auch deshal durchaus von Farblösungen des Handels ausgehen, was ich zwar selbst nicht versucht habe aber erfolgversprechend sein sollte.
Ebenso unkritisch ist der gesamte Ablauf, wenn die Reihenfolge eingehalten, der Schnitt nach der Differenzierung in Salzsäurealkohol sorgfältig in Wasser ausgewaschen und bei Einschluss in Harz direkt ohne überschüssiges Wasser zu verschleppen in 100% Isopropylalkohol entwässert wird.
Die Schnitte sind für den Workshop vorbereitet worden. Sprossstücke (auf ca. 5 bis 8 mm gekürzt) wurden in AFE fixiert und nach dem Auswaschen mit 70% Ethanol im Schlittenmikrotom geschnitten. Schnittdicke ist je Schneidbarkeit 25 bis 50 µm. AFE ist ein Fixiergemisch für botanische Objekte zusammengesetzt aus Alkohol, Eisessig und Formalin.
Zu den nachstehenden Aufnahmen: Stativ Axiostar plus, Mikroskopobjektiv A-Pan 10x, Digitale Spiegelreflexkamera Nikon D5000 über das Zeiss-Projektiv 1,6x adaptiert. Die Aufnahmen sind nicht nachbearbeitet, Massstabsbalken und Text wurden mit AxioVision light eingefügt, die beiden Übersichstaufnahmen mit Photomerge aus Einzelbilder zusammengesetzt.
Ein Arbeitsplan für die Färbung mit detailliertem Ablauf und dazugehörigen Zeiten kann als PDF hier heruntergeladen werden:
Arbeitsplan
Rolf-Dieter Müller
Literatur
Etzold H (1983): Eine kontrastreiche, simultane Mehrfachfärbung für pflanzenanatomische Präparate: Fuchsin-Safranin-Astrablau. Mikrokosmos 72 213.
Etzold, H. (2002): Simultanfärbung von Pflanzenschnitten mit Fuchsin, Chrysoidin und Astrablau. Mikrokosmos 91 316.
Henkel, Klaus: Die Mikrofibel. Ausgabe 14. Juni 2003. Seite 183-188.
Wacker, Robin: Eine neue und einfache Methode zur polychromatischen Anfärbung von Paraffinschnitten pflanzlicher Gewebe für Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie. Mikrokosmos Heft 4/2006, Seite 210-212.
